Bestimmung der Konzentration von Ethanol in alkoholfreien oder in Getränken mit 0.0 % vol. Alkohol mittels Gaschromatographie mit Headspace-Sampler und Flammenionisationsdetektor (FID).
Die Probe wird, gegebenenfalls nach Verdünnung, mit einer bekannten Menge eines internen Standards (n-Propanol) versetzt.
Die Probe wird bei einer bestimmten Temperatur in einem Headspace-Vial äquilibriert und ein Teil des Kopfraums in einen Gaschromatographen injiziert.
Der enthaltene Ethanol wird auf einer polaren Gaschromatographiesäule getrennt und mit einem Flammenionisationsdetektor (FID) nachgewiesen.
Aus dem Verhältnis von Fläche des Ethanolpeaks zur Fläche des internen Standards (n-Propanol) mit den Verhältnissen der gleichen Peaks, die bei der Analyse von Standards mit bekanntem Ethanolkonzentrationen ermittelt wurden, wird die Ethanolkonzentration in % vol. berechnet.
Bestimmung der Velcorin®-Dosage.
Aromatisierte Getränke, Flüssigteekonzentrat, Fruchtwein, alkoholfreier Wein
DMDC (Velcorin®) wird zur Kaltentkeimung von alkoholfreien Erfrischungsgetränken verwendet.
Gemäß Verordnung EG 1129/2011 [1] dürfen nichtalkoholische aromatisierte Getränke, alkoholfreier Wein und Flüssigteekonzentrate mit bis zu 250 mg/l DMDC versetzt werden.
Dimethyldicarbonat (Velcorin®) zerfällt in wässrigen Lösungen rasch und praktisch vollständig in Kohlensäure und Methanol. Zudem bilden sich geringe Mengen an Ethylmethylcarbonat (EMC) aus der Reaktion von DMDC mit Ethanol, das mittels GC-MS nachgewiesen werden kann [2]. Der Gehalt an zugesetztem DMDC kann über die Gehaltsbestimmung von EMC und Ethanol ermittelt werden. Über die quantitative Methanolbestimmung mittels GC kann die Velcorin®-Dosage überprüft werden. Hierbei muss jedoch der Methanolgehalt des Produkts vor Velcorin®-Dosage berücksichtigt werden.
Bestimmung von Ethanol mittels Enzymatik
Geeignet für Biere, alkoholfreie Biere, alkoholreduzierte Biere, Biermischgetränke, AFG, Säfte, Getränke
Ethanol wird durch Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD+) in Gegenwart des Enzyms Alkohol-Dehydrogenase (ADH) zu Acetaldehyd oxidiert:
Das Gleichgewicht dieser Reaktion liegt auf der Seite von Ethanol und NAD. Durch alkalisches Milieu und durch Abfangen des gebildeten Acetaldehyds kann das Gleichgewicht auf die rechte Seite verschoben werden. Acetaldehyd wird in Gegenwart von Aldehyd-Dehydrogenase (AI-DH) quantitativ zu Essigsäure oxidiert:
Die bei den Reaktionen gebildete NADH-Menge ist der halben Ethanolmenge äquivalent und wird aufgrund seiner Absorption bei 334, 340 oder 365 nm photometrisch bestimmt.
Spezifität der Bestimmung [1]
Der Einfluss von Aldehyden und Ketonen wird durch die Reihenfolge der Reagenzienzugabe beim Test ausgeschaltet. Methanol wird wegen ungünstiger KM-Werte (Michaelis-Menten-Konstante) der verwendeten Enzyme nicht umgesetzt.
n-Propanol und n-Butanol werden unter Testbedingungen quantitativ umgesetzt, höhere primäre Alkohole führen zu probeabhängigen Schleichreaktionen. Sekundäre, tertiäre und aromatische Alkohole reagieren nicht. Glycerin stört den Test auch bei höheren Konzentrationen nicht.
Alkoholfreie Getränke, Säfte, Wässer, Rohstoffe sowie ihre Beprobung.
Die alkoholfreien Getränke (AfG) lassen sich in drei Hauptgruppen einteilen:
Säfte und Nektare
Erfrischungsgetränke (z. B. Schorlen, Fruchtsaftgetränke, Limonaden, Brausen, aromatisierte Wässer, Sport- und Energygetränke, Mischgetränke etc.)
Wässer (Mineralwasser, Tafelwasser, Heilwasser etc.)
Zusätzlich werden Rohstoffe zur alkoholfreien Getränkeherstellung (Fruchtsaftkonzentrate, Grundstoffe, Aromen, Zuckersirupe etc.) aufgeführt.
Heiß- und Kaltgetränke wie Kaffee, Tee und Milch bleiben hier unberücksichtigt.
Die Wässer ausgenommen erfolgt diese regulatorische Einteilung aufgrund ihrer Beschaffenheit: hauptsächlich wegen ihres Saftgehalts (0-100 %), der Aromatisierung (natürlich, naturidentisch, künstlich) und diverser Inhaltsstoffe wie Koffein, Vitamine, Mineralien etc.
Mikrobiologische Sensitivität alkoholfreier Getränke
Die mikrobiologische Anfälligkeit alkoholfreier Getränke sollte aufgrund der Vielfalt der Untersuchungsmatrix differenziert betrachtet werden. Sie wird von folgenden wesentlichen Selektivkriterien geprägt:
Getränkeinhaltsstoffe:
Die mikrobiologische Sensitivität eines Getränkes wird über die spezifischen Wuchs- und Hemmstoffe ausgedrückt. Dazu zählen nährstoffreiche Substanzen wie Kohlenhydrate, Aminosäuren, Mineralien und Vitamine etc., welche die Grundlagen für mikrobiologisches Wachstum bieten. Die Anwesenheit von Fruchtsäuren, ätherischen Ölen oder auch der Mangel an Stickstoffquellen wirken dagegen wachstumshemmend und bilden somit einen zusätzlichen Eigenschutz von alkoholfreien Getränken.
pH-Wert:
Der pH-Wert eines Getränks spielt eine zentrale Rolle in der Getränkeherstellung und der mikrobiologischen Betrachtung. Durch die Absäuerung des Getränkes will man das Wachstum von pathogenen Mikroorganismen verhindern. Einen absoluten Grenzwert gibt es allerdings nicht. In der Praxis wird der pH-Wert um < 4,3 als ausreichender Schutz gesehen, abhängig von der Beschaffenheit des Getränkes und seiner Inhaltsstoffe. Ausnahmen bilden z. B. Gemüsesäfte.
Aerobiose/Anaerobiose:
Durch das Karbonisieren von Getränken wird ein anaerobes Umfeld geschaffen, um u. a. das Wachstum aerober Mikroorganismen weitgehend zu unterdrücken. Je nach Verpackungsart muss ausreichend CO2 eingebracht werden, um Gasverluste durch Migration im Verlauf der Mindesthaltbarkeit auszugleichen. Zum Beispiel werden mindestens 3-4 g/l CO2 bei der Verwendung von leichten PET-Flaschen empfohlen.
Generell werden in der AfG-Industrie die Gruppen der acidophilen und -toleranten, aeroben und fakultativ anaeroben sowie anaeroben Mikroorganismen als potenziell getränkeschädigend identifiziert, vorausgesetzt der pH-Wert der Produkte liegt im sauren Bereich (pH-Wert < 4,3). Bei AfG mit kritischeren pH-Werten (> 4,3) erhöht sich die Relevanz der mesophilen und thermophilen Keime und potenziell pathogener Mikroorganismen.
Auch osmophile/osmotolerante Keime müssen in Betracht gezogen werden. Diese können als Verderber vor allem in hochkonzentrierten Rohwaren für die Getränkeherstellung vorkommen. Dazu zählen z. B. Fruchtsaftkonzentrate, Fruchtmark, Fruchtzubereitungen, Grundstoffe, aber auch Zuckersirupe etc.
Bei den Getränkeschädlingen alkoholfreier stiller Getränke handelt es sich im Generellen um alle Hefen, Essigsäurebakterien, Schimmelpilze und Alicyclobazillen. In Abhängigkeit des pH-Werts werden weitere Keime wie Bacillus sp. relevant.
In karbonisierten alkoholfreien Getränken sind vor allem gärfähige und gärkräftige Hefen, aber auch andere Mikroorganismen wie Milchsäurebakterien von Bedeutung. In Abhängigkeit des pH-Werts können weitere Keime wie Bacillus sp. oder potenziell pathogene Keime wie Clostridium sp. auftreten.
Die aufgeführten Gruppen der Getränkeschädlinge können sowohl als Primärkontaminanten aus den entsprechenden Rohwaren oder als Sekundärkontaminanten eingestuft werden.
Aufgrund der Komplexität und Vielfalt im AfG-Bereich sind die mikrobiologischen Kontrollen und Analysen, sowohl im Herstellprozess als auch in den Endprodukten je nach Produktgruppe differenziert zu betrachten. Die Anforderungen richten sich dabei immer nach den jeweiligen vorliegenden spezifischen Selektivkriterien der Produkte.
Die Methode beschreibt die Untersuchung von Wasser im AfG-Bereich.
Wasser im AfG-Bereich.
Die Untersuchungen von Wasserproben können in Abhängigkeit des zu analysierenden Zielorganismus nach den Vorgaben der Trinkwasser- bzw. Mineral- und Tafelwasserverordnung vorgenommen werden [1, 2] (siehe M-020.00 Mineral-, Quell- und Tafelwasser, Einführung in die mikrobiologische Untersuchung).
Belastungen des Wassers im AfG-Bereich mit allgemeinen relevanten Getränkeschädlingen sollten nach den Vorgaben der MEBAK®-Methoden
M-532.00 Untersuchung von Rohstoffproben im AfG-Bereich
M-533.00 Untersuchung von alkoholfreien, trüben, nicht filtrierbaren Getränken mit pH < 4,3
M-534.00 Untersuchung von klaren, alkoholfreien Getränken mit pH < 4,3
M-535.00 Untersuchung von empfindlichen alkoholfreien Getränken mit pH > 4,3
M-536.00 Nachweis von Alicyclobacillus spp. in alkoholfreien Getränken und deren Rohstoffen
überprüft werden.
Nachweis schädlicher osmophiler und –toleranter Hefen, Schimmelpilze und Bakterien in AfG-Rohstoffproben.
Rohstoffproben (z. B. Fruchtsaftkonzentrate, Zuckersirup usw.) im AfG-Bereich.
Halbwaren wie Fruchtsaftkonzentrate oder Zuckersirupe verweisen aufgrund der meist sehr niedrigen Wasseraktivität (kleiner Aw-Wert) und des hohen osmotischen Druckes (hoher Brix-Wert) auf einen hohen mikrobiologischen Eigenschutz. So sind überwiegend osmophile und -tolerante Keime zu erwarten. Nur wenige können sich nach einer Rückverdünnung produktschädigend auswirken.