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Lichtmikroskop mit Fluoreszenzanwendung

Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine lichtmikroskopische Methode, bei der der physikalische Effekt der Fluoreszenz genutzt wird. Dabei wird UV- oder kurzwelliges sichtbares Licht bestimmter Wellenlängen (Anregungslicht) von fluoreszenten Stoffen absorbiert und als Folge der Stokes-Verschiebung als längerwellige Strahlung (Emissionslicht) emittiert. Das Bild wird, anders als im Hellfeldmikroskop, erst durch das emittierte Licht erzeugt. Fluoreszenzmikroskope eignen sich somit nur für Proben mit Eigenfluoreszenz bzw. für Proben, in die fluoreszierende Stoffe eingebracht werden können.

Aufbau und Funktionsweise:

Aus einer Lichtquelle wird mittels Anregungsfilter die gewünschte Wellenlänge herausgefiltert und auf einen dichroitischen Spiegel geworfen. Dichroitische Spiegel reflektieren Licht nur unterhalb einer kritischen Wellenlänge. Oberhalb dieser Wellenlänge kann das Licht den Spiegel passieren. Das so durch das Objektiv zum Präparat gespiegelte Anregungslicht wird nun durch die Elektronen der fluoreszenten Stoffe absorbiert. Infolgedessen gelangen diese in einen energetisch höheren Zustand. Aufgrund der Instabilität dieses Zustandes fallen die Elektronen unter Freisetzung der aufgenommenen Energie aber wieder in ihren Grundzustand zurück. Das resultierende Emissionslicht ist energetisch ärmer und hat dadurch eine längere Wellenlänge. Dieses durch das Objektiv zurückgeworfene längerwellige Emissionslicht kann den dichroitischen Spiegel passieren und gelangt so zum Okular bzw. Detektor. Ein zusätzlicher optischer Filter eliminiert restliches Anregungslicht, so dass möglichst nur Emissionslicht detektiert wird. Das Bild des Präparats erscheint dann in der jeweiligen Emissionsfarbe auf schwarzen Grund.

Abb. 1: Schematischer Aufbau eines Fluoreszenzmikroskops

Quelle: https://de.wikipedia.org/wiki/Fluoreszenzmikroskopie (abgerufen am 19.10.2024)
Autor und Lizenz: Krzysztof Blachnicki, derivative work: user Dietzel65; https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/ (abgerufen am 19.10.2024)

Stereomikroskop

Stereomikroskope als Sonderform der Lichtmikroskope unterscheiden sich von allen anderen Mikroskopen durch zwei getrennte Strahlengänge. Durch diese Besonderheit können Präparate und insbesondere Oberflächenstrukturen dreidimensional betrachtet werden.

Aufbau und Funktionsweise:

Für jedes Auge wird ein separater Strahlengang zur Verfügung gestellt, wobei die Strahlengänge in unterschiedlichen Winkeln auf das Präparat laufen und damit einen Stereoeffekt erzeugen. Durch spezielle Prismen lassen sich Objekte somit seitenrichtig und dreidimensional vergrößern. Die bauartbedingte maximale Vergrößerung liegt bei etwa 100:1.

Geräte zur Bestimmung von Zellzahlen in Flüssigkeiten

Die klassische Methode zur Bestimmung der Lebendzellzahlen ist das Ausplattieren der Suspension auf eine geeignete Agarplatte. Dieses Verfahren ist jedoch arbeits- und zeitaufwendig, darüber hinaus stellen sowohl das Anlegen etwaiger Verdünnungsreihen und das Ausplattieren als auch das Auswerten der Ergebnisse potentielle Fehlerquellen dar. Schneller und einfacher erfolgt die Bestimmung von Zellzahlen mit Hilfe von Zählkammern am Mikroskop oder mittels automatisierter Zellzählsysteme.

Am Markt sind verschiedenste Zählkammern verfügbar - diese unterscheiden sich hauptsächlich hinsichtlich der aufgebrachten Zählnetze und der Kammertiefen. Bei Hefen finden Zählkammern mit einer Kammertiefe von 0,1 mm Anwendung, für Bakterien hingegen werden Zählkammern mit einer Kammertiefe von 0,01 mm genutzt. Aus der Kammertiefe und dem Zählnetz, welches mittels Gitternetzlinien definierte Flächen beschreibt, lässt sich ein der Zählung entsprechendes Bezugsvolumen berechnen. Somit können die Ergebnisse in Zellen/ml o. ä. angeben werden. Um den eigentlichen Zählprozess zu erleichtern, werden sogenannte Handstückzähler verwendet. Bei entsprechender Behandlung der Probe mit Färbereagenzien besteht außerdem die Möglichkeit der quantitativen Lebend-Tot-Unterscheidung (Viabilität).

Automatisierte Zählsysteme arbeiten auf Grundlage verschiedener Detektions- und Zählmechanismen.

Zellzählsysteme mit automatisierter Bilderkennung arbeiten ähnlich den Zählkammern mit einem definierten Bezugsvolumen und entsprechenden Auswertealgorithmen. Dabei wird, je nach System, die Gesamtzellzahl des Auswertefeldes ermittelt. Bei Anwendung von Färbreagenzien (z. B. Methylenblau) kann auch die Anzahl der gefärbten Zellen zur Bestimmung der Viabilität gemessen werden. Andere Systeme arbeiten mit Fluoreszenzfarbstoffen, welche in die Zellen der Probe eindringen und von einem integrierten Detektor identifiziert und gezählt werden können. Da entsprechende Fluoreszenzfarbstoffe nur in tote Zellen eindringen und dort binden können, wird ohne weitere Reagenzien nur der Totanteil der Zellen ermittelt. Unter Zuhilfenahme eines Lysepuffers o. ä. lässt sich aber auch die Gesamtzellzahl bestimmen und aus beiden Messungen die Viabilität berechnen.

Messgeräte, die auf dem Prinzip der Coulter-Partikelzählung basieren, eignen sich neben der Ermittlung der Gesamtzellzahl auch zur Größenbestimmung der gemessenen Zellen. Die Coulter-Zählung misst die Änderung des elektrischen Widerstandes (Impedanz) zwischen zwei, in Reaktionskammern einzeln angeordneten Elektroden. Ein kleines Volumen der zu messenden Probe wird, mit einer leitfähigen Elektrolytlösung verdünnt, in eine Kammer eingebracht und anschließend automatisch durch eine Kapillare oder Öffnung geeigneter Größe in die zweite Reaktionskammer gesaugt. Jede Zelle verdrängt dabei ein ihrem eigenen Volumen entsprechendes Elektrolytvolumen und verändert beim Durchgang durch die Öffnung den elektrischen Widerstand zwischen den Elektroden. Gemessen wird dabei die Stromspannung oder der Stromimpuls. Ein kurzer Anstieg des Widerstandes wird als eine Zelle detektiert. Die Höhe des Stromimpulses ist proportional zum Volumen der detektierten Zelle.

Auch mit einem Durchflusszytometer lassen sich die Zellzahlen einer Suspension bestimmen, hier mittels einer laserbasierten Messung. Die Probe wird in einem Flüssigkeitsstrom durch den Laserstrahl geleitet und die Lichtstreuung (Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht) mit Detektoren gemessen.

Mikrobiologische Sicherheitswerkbank

Grundsätzlich existieren drei Klassen von Mikrobiologischen Sicherheitswerkbänken. Sicherheitswerkbänke der Klasse I bieten lediglich dem Arbeitenden, nicht aber dem Arbeitsgegenstand Schutz vor Kontaminationen. Für die Verwendung im mikrobiologischen Brauereilabor eignen sich Sicherheitswerkbänke der Klasse II - sie gewähren sowohl dem Arbeitenden als auch dem Arbeitsgegenstand Schutz. Die Sicherheitswerkbänke der Klasse III sind vollständig geschlossene Systeme für einen  erhöhten Schutz des Arbeitenden. Dies wird erreicht durch fest eingebaute Handschuhe, Schleusen, ständig anliegenden Unterdruck sowie Zu- und Abluftfiltration. Die erhöhte Schutzstufe führt aber auch zu komplizierteren Arbeitsabläufen.

Aufbau und Funktionsweise einer Sicherheitswerkbank Klasse II:

Durch die Arbeitsöffnung wird Raumluft angesaugt und mit Aerosolen und Partikeln einem Schwebstofffilter zugeführt. Ein Teil der gefilterten Abluft wird in laminarer Strömung von oben nach unten entlang der geöffneten Frontscheibe geleitet und gemeinsam mit Raumluft wieder nach unten zum Filter abgesaugt. Durch dieses Kreislaufprinzip wird einerseits eine Kontamination der Umgebung verhindert, andererseits wird die angesaugte Frischluft vor Kontakt mit dem Arbeitsgegenstand gereinigt. Die Sicherheitswerkbänke verfügen über eine sensorgesteuerte Funktionsüberwachung mit Alarmfunktion.

Spektralphotometer

Spektralphotometer finden in der Brauereianalytik u. a. Verwendung bei der Messung von Konzentrationen. Hierfür wird Licht einer bestimmten Wellenlänge in einem Strahlengang durch die Probe geleitet und die durch die Probeninhaltsstoffe bedingte Lichtabschwächung registriert. Für weitere Anwendungen, z. B. in der Wasseranalytik oder für enzymatische Analysen, sind diverse konfektionierte Küvettentestkits sowie Reagenzientestsystem erhältlich.

Man unterscheidet zwischen Einstrahl- und Zweistrahlphotometern. Während Einstrahlsysteme ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis aufweisen, zeichnen sich Zweistrahlphotometer durch eine höhere Messstabilität aus. Häufig sind die verwendeten Geräte sogenannte UV/VIS-Photometer, welche neben dem für das menschliche Auge sichtbare Licht (VIS) auch den ultravioletten Bereich (UV) ausnutzen.

Aufbau und Funktionsweise:

Eine Lichtquelle strahlt polychromatisches Licht aus, welches im Monochromator so zerlegt wird, dass es diesen nur mit einer bestimmten Wellenlänge verlässt. Das durch den Austrittspalt gelangende monochromatische Licht durchtritt anschließend die in einer Küvette vorliegende Probe. Hier wird ein Teil des Lichtes absorbiert. Der nachgeschaltete Detektor misst die Intensität des durch die Probe tretenden Lichtes.

Abb. 2: Messprinzip eines Einstrahl-Absorptionsspktrometers

Quelle: https://de.wikipedia.org/wiki/Spektralphotometer#/media/Datei:Photometer_mit_Monochromator.png (abgerufen am 19.10.2024)
Autor und Lizenz: Autor Sciencia58; https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Photometer_mit_Monochromator.png

Zentrifuge

Laborzentrifugen unterstützen die Stofftrennung und finden u. a. Verwendung in der Probenaufbereitung. Die Proben werden dafür in geeignete Gefäße überführt und anschließend in einem Rotor in eine gleichförmige Kreisbewegung gebracht. Die von der Drehzahl und der Rotorgeometrie abhängige, resultierende Zentrifugalkraft wirkt auf die Probeninhaltsstoffe, welche aufgrund ihrer eigenen Massenträgheit getrennt werden.

PCR-Thermocycler

Die PCR (Polymerase-Kettenreaktion) hat sich im Brauerei- und Getränkebereich zu einer etablierten alternativen Nachweismethode entwickelt und ermöglicht eine exakte und schnelle Detektion von brauereirelevanten Bakterien und Hefen. Die PCR ist eine in-vitro-Technik, mit der man gezielt Desoxyribonukleinsäure-Abschnitte (DNA-Abschnitte) vervielfältigen kann.

Grundvoraussetzung zur Durchführung einer PCR ist neben den entsprechenden PCR-Chemikalien (PCR-Kits) ein PCR-Thermocycler. Unter einem Thermocycler versteht man ein Gerät, das in der Lage ist, die Temperaturzyklen einer PCR selbstständig durchzuführen. Ein PCR-Thermocycler muss die eingesetzten Reaktionsgefäße möglichst schnell und punktgenau aufheizen und abkühlen können. Klassischerweise werden hier Temperaturen zwischen 95 °C und 60 °C bzw. 72 °C zyklisch durchlaufen.

PCR-Thermocycler unterscheiden sich je nach Hersteller in den zu verwendenden Reaktionsgefäßen und in der Art und Weise wie die Reaktionsgefäße erwärmt und gekühlt werden. Ein weiterer entscheidender Unterschied besteht in der Art der Auswertung des PCR-Ergebnisses. Standard-Thermocycler in Ihrer ursprünglichen Form können lediglich heizen und kühlen. Die Auswertung bei dieser Art der PCR erfolgt auf unterschiedliche Arten (z. B. Elektrophorese) nach der eigentlichen PCR-Reaktion.

Im Gegensatz dazu stellen sog. Real-time PCR-Thermocycler bereits während der Reaktion eine Ergebnisinterpretation zur Verfügung. Diese Geräte besitzen zusätzlich eine Auswerteeinrichtung, die die Fluoreszenzsignale eines der Reaktion beigefügten Farbstoffs messen und auswerten kann. Ohne diese optische Auswerteeinheit müsste die PCR-Auswertung erst durch eine zusätzliche Reaktion nach der eigentlichen PCR-Reaktion stattfinden (z. B. durch eine Gelelektrophorese). Die technische Entwicklung im Bereich der Real-time PCR-Themocycler hat die Analyse beschleunigt, vereinfacht und sehr dazu beigetragen, die Methode im Brauereiumfeld zu etablieren.

Durchflusszytometer

Die Durchflusszytometrie oder auch Flowzytometrie ermöglicht die automatisierte Messung von Partikel- oder Zelleigenschaften in Suspension durch eine simultane, multiparametrische Analyse der eingebrachten Probe. Neben der Zellzählung im Flüssigkeitsstrom ist die Differenzierung anhand physikalischer und molekularer Eigenschaften sowie die Verwendung von einer oder mehreren Fluoreszenzfarbstoff-Markierungen möglich.

Aufbau und Funktionsweise:

Das Funktionsprinzip flowzytometrischer Messungen basiert auf der Emission von optischen Signalen durch die in der Probe enthaltenen Partikel. Meistens handelt es sich dabei um Zellen. Im fluidischen System des Durchflusszytometers erfolgt die Echtzeit-Erfassung der Partikel, bei der auf volumetrischer Basis eine absolute Zellzählung ermöglicht wird. Dafür wird das Probenmaterial von einem Hüllstrom aus isotoner Pufferlösung umgeben und in einem laminaren Strom durch eine Querschnittsverengung gesaugt. Durch diesen als hydrodynamische Fokussierung bezeichneten Prozess erfolgt eine Vereinzelung der Zellen.

Die so vereinzelte Probe passiert in der Messzelle einen oder mehrere Laser mit bestimmten Anregungswellenlängen, zum Teil finden auch Xenon- oder Argonlampen Verwendung. Aus dem resultierenden Streulicht und den Fluoreszenzemissionen lassen sich mittels entsprechender Detektoren (Photomultiplier) elektrische Signale erzeugen, welche proportional zur Intensität des ursprünglich eingefallenen Lichtes sind.

Man unterscheidet zwischen Streusignalen und Fluoreszenzsignalen. Streusignale der Vorwärtslichtstreuung lassen dabei Rückschlüsse auf die relative Größe der Partikel zu, wohingegen Signale des Seitwärtsstreulichtes Rückschlüsse auf die strukturellen Eigenschaften und die Granularität erlauben. Die Fluoreszenzsignale sind abhängig von enthaltenen oder gebundenen Fluorochrommolekülen. Welche Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt werden, ist dabei von einer Vielzahl von Faktoren abhängig, z. B. Geräteausstattung (Laser, Filter und Detektoren), Wechselwirkungen mit weiteren Farbstoffen und der zu bestimmende Parameter.

Folgende Parameter der Zellanalyse lassen sich u. a. mittels Flowzytometrie ermitteln, wobei je nach Assay auch mehrere Eigenschaften gleichzeitig erfasst werden können:

Physiologische Parameter:

Zellwachstum

metabolische Aktivität

Membranpotential

Membranintegrität

Bindungsstellen für Fluorochrome bzw. Fluoreszenz-Parameter sind:

Nukleinsäuren (DNA, RNA)

Proteine

Lipide

intrazellulärer pH-Wert

fluoreszierende Substrate

Membranpotential

Kationen (Ca²⁺)

Antikörper

autofluoreszierende Proteine

etc.

MALDI-TOF-Massenspektrometrie

Die Massenanalyse mittels MALDI (Matrix-Assistierte Laser Desorption-Ionisation) und anschließender Flugzeitanalyse (TOF = Time of Flight) eignet sich zur schnellen Identifizierung von Mikroorganismen. Die Spektren zur mikrobiologischen Identifizierung zeigen in der Regel spezifische Peptidprofile bzw. Proteinprofile ribosomaler Proteine.

Aufbau und Funktionsweise:

Eine Probe wird mit einer schützenden Flüssigmatrix auf einen Probenträger aufgebracht und dort durch Kristallisation fixiert. Zu Beginn der Messung wird mittels eines gepulsten Lasers die Matrix verdampft und die in ihr gebundenen Biomoleküle herausgelöst (Desorption) und ionisiert. Anschließend werden die Ionen in einem elektrischen Feld beschleunigt und mittels Flugzeit-Massenspektrometer detektiert.

Die generierten Spektren können mit Referenzspektren aus einer Datenbank abgeglichen werden und führen somit zur Identifizierung der Probe. Wichtig ist die Verwendung von Reinkulturen, eine vorherige Keimisolierung ist zwingend notwendig.

FT-IR-Spektrometer

Ein Fourier-Transformations-Infrarotspektrometer ermöglicht in der Brauereimikrobiologie eine schnelle und kostengünstige Identifizierung von Bakterien und Hefen. Aus einem mittels FT-IR-Spektrometer gemessenen Interferogramm wird mittels Fourier-Transformation ein spezifisches Spektrum berechnet, welches anschließend mit einer entsprechenden Datenbank abgeglichen werden kann.

Voraussetzung für eine erfolgreiche Identifizierung ist die Verwendung von Reinkulturen, so dass eine vorherige Isolierung notwendig ist. Weiterhin sind standardisierte Wachstumsbedingungen erforderlich, da sich Abweichungen direkt auf das finale Spektrum auswirken.

Visuelle Betrachtung des aufgeschnittenen Mehlkörpers einzelner Körner

Mikroskopische Kontrolle auf Würzebakterien sowie Überprüfung auf Würzebakteriengeruch.

Der mikroskopische Nachweis von bierschädlichen Bakterien erübrigt eine notwendige Anreicherung.

Mikroskopieren der Probe im Dunkelfeld.

Mikroskopische Kontrolle des Bodensatzes auf obligate Bierschädlinge und wilde Hefen durch selektive Anreicherung.

Erstellung eines mikroskopischen Präparats zur Identifizierung von Probenmaterial bekannter und/oder unbekannter Herkunft.