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Mikroskopieren der Probe im Dunkelfeld.

Vor allem Präparate mit kleinen Strukturen werden im Dunkelfeld untersucht. Besonders für kontrastarme Mikroorganismen wie z. B. Milchsäurebakterien ist dieses Verfahren geeignet.

Zur Identifizierung und Beurteilung von Mikroorganismen werden u. a. ihre morphologischen Eigenschaften mikroskopisch bestimmt. Mikroorganismen mit einer dickeren Zellwand (z. B. dickere Mureinschicht bei gram-positiven Bakterien) brechen das Licht stärker und können so eine Vorabeinschätzung liefern.

Lichtmikroskop (Hellfeld/Dunkelfeld/Phasenkontrast)

Zentrale Rolle bei der Auswertung von mikrobiologischen Proben spielt das Lichtmikroskop. In Abbildung 1 ist der exemplarische Aufbau eines Lichtmikroskops zu sehen. Die Erläuterung zu Aufbau und Funktionsweise sollen die wichtigsten Komponenten knapp erläutern. Es sollen die notwendigen Informationen bereitgestellt werden, damit ein Betrieb beurteilen kann, ob das verwendete Mikroskop prinzipiell geeignet ist bzw. damit Fall einer Neuanschaffung wichtige Hardware Konfigurationen korrekt aufeinander abgestimmt sind. Informationen zur korrekten Einstellung und Inbetriebnahme (z. B. Köhlern) werden an der Stelle nicht geliefert. Detailliertere Informationen hierzu können Literatur 1 entnommen werden (S. 203-233).

Abb. 1: Aufbau und Bestandteile eines Lichtmikroskops

Aufbau und Funktion eines Lichtmikroskops [2, 3, 4, 5]

Das Lichtmikroskop setzt sich aus zwei verschiedenen optischen Systemen zusammen, welche die zu untersuchenden Objekte in zwei Stufen vergrößern:

Objektiv: erzeugt ein vergrößertes, seitenverkehrtes Projektionsbild der zu betrachtenden Objekte, das sogenannte Zwischenbild

Okular: eine Lupe, mit deren Hilfe das Zwischenbild zum Endbild nachvergrößert wird

Die Gesamtvergrößerung ergibt sich somit aus dem Produkt aus Okular- und Objektivvergrößerung. Für die Leistungsfähigkeit eines Mikroskops ist in erster Linie die Güte der Objektive von Bedeutung. Die Strukturen, die das Objektiv im Zwischenbild nicht abbildet, können auch durch qualitativ hochwertige Okulare nicht vergrößert werden.

Neben der Gesamtvergrößerung ist das Auflösungsvermögen eines Mikroskops eine wichtige Kennzahl. Das Auflösungsvermögen wird bestimmt durch die numerische Apertur des Objektivs. Das Auflösungsvermögen eines Objektivs ist, vereinfacht ausgedrückt, davon abhängig, wie viel Licht von einer Struktur des Präparates in das Objektiv gelangt. Diese Lichtmenge ist wiederum abhängig vom Öffnungswinkel des entsprechenden Objektivs. Je größer der Öffnungswinkel ist, desto besser löst ein Objektiv Details eines Präparates auf. Dennoch wird nicht der Öffnungswinkel, sondern die numerische Apertur (= Objektivapertur) auf dem Objektiv angegeben. Wie gut ein Objektiv Details auflöst, hängt neben dem Öffnungswinkel auch von der Brechzahl des Mediums zwischen Deckglas und Objektiv ab. Je höher der Wert für die numerische Apertur ist, desto größer ist auch das Auflösungsvermögen eines Objektivs (Abb. 2). Befindet sich zwischen Objektiv und Deckglas Luft (Brechzahl ca. 1,0), so berechnet sich das Auflösungsvermögen nur nach dem Sinus des halben Öffnungswinkels. Der theoretisch erreichbare höchste Wert der numerischen Apertur würde dann genau 1,0 betragen. Hierzu wäre jedoch ein Objektiv mit unendlich großer Frontlinse bei gleichzeitig gegen Null gehendem Arbeitsabstand (= Abstand zwischen Objektiv und Präparat) erforderlich. Aus naheliegenden Gründen kann es ein derartiges Objektiv nicht geben. Die in der Praxis erreichbare numerische Apertur liegt deshalb bei maximal 0,95.

Die numerische Apertur A berechnet sich wie folgt:

A = n × sin σ

n: Brechzahl des Mediums zwischen Deckglas und Frontlinse des Objektivs (für Luft beträgt die Brechzahl ca. 1)

σ: Halber Öffnungswinkel des Objektivs

Abb. 2: Zusammenhang zwischen Öffnungswinkel und Auflösungsvermögen

Quelle: http://www.mikroskopie.de/kurse/apertur.htm (abgerufen am 17.11.2024)

Eine Erhöhung des Auflösungsvermögens ließe sich erreichen durch die Verwendung von speziellen Objektiven, die für die Anwendung von Immersionsöl geeignet wären. Bei den sogenannten Immersionsobjektiven wird zwischen Deckglas und Objektiv ein Immersionsöl aufgebracht, welches einen größeren Brechungsindex aufweist. Dadurch gelangen auch stärker geneigte Lichtstrahlen noch in das Objektiv. Das Objektiv taucht in diesem Fall in den Tropfen Immersionsöl ein. Die Objektive müssen nach Benutzung gesäubert werden.

Da das Auflösungsvermögen von der durch das Objektiv aufgenommenen "Lichtmenge" abhängt, nimmt mit der numerischen Apertur natürlich auch das Auflösungsvermögen des Objektivs zu. Ölimmersionsobjektive können numerische Aperturen bis etwa 1,40 erreichen. Höhere numerische Aperturen sind mit gängigen Lichtmikroskopen nicht zu erreichen. Die Fähigkeit eines Objektivs, zwei benachbarte Details im Präparat aufzulösen, hängt von dessen numerischer Apertur ab.

Die nachfolgende Formel, dient der Berechnung des theoretisch möglichen Auflösungsvermögens eines Objektivs aus der numerischen Apertur:

d = λ/2 × A

d: minimaler Abstand zwischen zwei Punkten, der noch erkannt werden kann

λ: Wellenlänge des Lichts

A: numerische Apertur (n. A.)

Das menschliche Auge ist ohne Hilfsmittel in der Lage Einzelheiten zu unterscheiden, die etwa 0,2 bis 0,3 mm voneinander entfernt liegen. Aus diesen Werten ergibt sich gleichzeitig die mit Lichtmikroskopen erzielbare, sinnvolle Vergrößerung. Diese maximale Vergrößerung liegt, bei der Anwendung eines Immersionsobjektivs mit hoher numerischer Apertur, genau wie das Auflösungsvermögen etwa bei dem Faktor 1000. Deshalb wird auch bei sehr teuren Mikroskopen eine Gesamtvergrößerung von 1000-fach in der Regel nicht überschritten.

Prinzipiell ist es möglich eine bestimmte mikroskopische Gesamtvergrößerung durch unterschiedliche Kombinationen aus Objektiv und Okular zu erreichen. Wer beispielsweise ein Objektiv 40x (n. A. 0,65) und ein Okular 25x kombiniert, erreicht die gleiche Gesamtvergrößerung, wie bei der Kombination Objektiv 100x (n. A. 1,25) und Okular 10x. Dennoch wird sich das mikroskopische Bild beider Kombinationen erheblich unterscheiden. Die numerische Apertur eines Objektivs bestimmt dessen Auflösungsvermögen. Das Okular kann das vom Objektiv erzeugte Bild nur nachvergrößern. Details, die schon das Objektiv nicht mehr auflöst, kann auch ein noch so stark vergrößerndes Okular nicht wieder hinzufügen. In der Regel sollte die Gesamtvergrößerung aus Objektiv und Okular nicht über dem 500- bis 1000-fachen der numerischen Apertur des verwendeten Objektivs liegen (sogenannte förderliche Vergrößerung). Ein Objektiv 40x (n. A. 0,65) liefert in der obigen Kombination mit einem Okular 25x zwar eine tausendfache Vergrößerung, das Bild wirkt jedoch "optisch leer", da die förderliche Vergrößerung deutlich überschritten wird.

Für die förderliche Gesamtvergrößerung gilt somit: förderliche Vergrößerung < A × 1000

Aus den obenstehenden Erläuterungen ergeben sich zusammenfassend folgende Punkte für die Anwendung in Brauereien:

für die Anwendung im Laboralltag empfehlen sich in den meisten Fällen Trockenobjektive ohne Ölimmersion. Trockenobjektive sind unkomplizierter in der Handhabung, da diese nicht gereinigt werden müssen

mit Trockenobjektiven sollten sich maximale Vergrößerungen von 640- bis ca. 800-fach erreichen lassen

die Kombination aus Okular und Objektiv sollte kleiner sein als A × 1000

Objektive mit hoher Apertur liefern ein hohes Auflösungsvermögen, allerdings ist der Kontrast geringer; für Objektive mit geringer Apertur gelten die umgekehrten Sachverhalte

die Werte für die Vergrößerungen von Okular und Objektiv sind jeweils auf den Bauteilen vermerkt. Zudem ist auf den Objektiven neben der Objektivvergrößerung die numerische Apertur vermerkt. Für ein 10er Objektiv wäre eine typische Beschriftung: 10/0,25 (10 = Vergrößerung, 0,25 = numerische Apertur)

Beleuchtungsarten (Hellfeld/Dunkelfeld/Phasenkontrast)

Durch die Wahl unterschiedlicher Kondensoren bzw. durch das Einbringen von Blenden in den Strahlengang können unterschiedliche Darstellungsformen (z. B. Phasenkontrast oder Dunkelfeld) realisiert werden. Diese Blenden können mittels eines Schiebers oder mittels Einsteckblenden in den Kondensor eingebracht werden. Am komfortabelsten für den Benutzer ist die gezielte Einbringung der Blenden mittels eines Ringblendenrevolvers (siehe Abb. 1), da hier in der Regel alle verfügbaren Blenden integriert sind und sehr einfach die entsprechende Blende ausgewählt werden kann.

Hellfeldmikroskopie:

Die Hellfeldmikroskopie ist die einfachste und grundlegendste Methode im Lichtmikroskop. Dabei wird das Präparat von unten durch einen Lichtkegel beleuchtet. Befindet sich kein Objekt im Strahlengang, so treffen die Lichtstrahlen ungestört ins Objektiv und man erhält ein gleichmäßig helles Bild.

Der Strahlengang bei der Hellfeldmikroskopie sieht typischerweise wie folgt aus (Abb. 3).

Abb. 3: Strahlengang des Lichts bei Hellfeldmikroskopie

Die zu betrachtenden Objekte (z. B. Hefen und Bakterien) sind relativ kontrastarm, so dass der Umriss und die Zellinhaltsstoffe der Objekte nur schwach zu erkennen sind. Präparate ohne Färbung sind somit nur eingeschränkt auswertbar.

Allerdings lässt sich die Hellfeldmikroskopie gut mit Färbemethoden kombinieren. So verwendet man zur Lebend-Tot-Bestimmung von Hefen z. B. Methylenblau als Farbstoff, da sich gefärbte Zellen gut vor einem hellen Hintergrund abheben.

Phasenkontrastmikroskopie:

Das Phasenkontrast-Verfahren ist ein Abbildungsverfahren in der Lichtmikroskopie, bei dem eine direkte Abbildung von Strukturen ermöglicht wird, die nur einen geringen Eigenkontrast aufweisen und bei der Hellfeldmikroskopie nur mit künstlicher Einfärbung gut sichtbar wären. Auf die physikalischen Hintergründe des Verfahrens wird an dieser Stelle nicht eingegangen. Vorteil der Methode ist, dass sich im Gegensatz zur Hellfeldmikroskopie kontrastreiche Bilder ohne die Notwendigkeit einer Färbung erzeugen lassen.

Eine spezielle Anwendung der Phasenkontrastmikroskopie im Brauereibereich ist die Unterscheidung von lebenden und toten Hefezellen: Tote Hefezellen erscheinen im mikroskopischen Bild dunkler als lebende.

Dunkelfeldmikroskopie:

Ein sehr gut geeignetes Verfahren zur Unterscheidung und zur Identifikation brauereirelevanter Mikroorganismen ist die Dunkelfeldmikroskopie. Sie führt zu einem dunklen Bildhintergrund, vor dem sich die zu beobachtenden Strukturen hell abheben. Dadurch können von durchsichtigen Objekten mit nur sehr geringem Kontrast gut aufgelöste, kontrastreiche Bilder erzeugt werden, ohne dass eine vorherige Färbung des Präparats erforderlich ist. Die gesamte Morphologie, d. h. Zellform, Zellinhaltsstoffe (z. B. Lipidgranula) sowie die Beweglichkeit von Objekten sind gut beobachtbar.

Das Prinzip der Dunkelfeldmikroskopie beruht darauf, dass die Objekte Licht nicht nur absorbieren, sondern auch immer einen Teil des Lichtstrahls ablenken. Die zentralen Lichtstrahlen werden mittels einer Zentralblende (1) ausgeblendet. Somit werden am Kondensor (2) nur die am Rand des Kondensors auftreffenden Lichtstrahlen abgelenkt. Die Strahlen kreuzen sich in der Objektebene und gehen – soweit keine Ablenkung erfolgt – am Objektiv vorbei. Der Betrachter sieht somit ein dunkles Bild. Sobald auf der Objektebene Partikel eingebracht werden, streuen diese das Licht, das Streulicht gelangt ins Objektiv und kann betrachtet werden (Abb. 4).

Abb. 4: Strahlengang des Lichts bei der Dunkelfeldmikroskopie

Je stärker Objekte das Licht streuen, desto intensiver leuchtend erscheinen diese Objekte bei der Betrachtung im Dunkelfeld. Diese Eigenschaft lässt in vielen Fällen Rückschlüsse auf den zu betrachtenden Keim zu. So sind z. B. Endosporen stark lichtbrechend und erscheinen im Dunkelfeld somit als Objekte mit einer intensiv leuchtenden äußeren Hülle. Mikroorganismen mit einer dicken Zellwand, z. B. Hefen oder Laktobazillen, als Vertreter der grampositiven Bakterien, erscheinen i. d. R. ebenfalls stark lichtbrechend.

Mikroorganismen mit einer dünnen Zellwand, z. B. E. coli oder Pseudomonaden als Vertreter der gram-negativen Bakterien, erscheinen häufig weniger stark lichtbrechend.